Molekularne techniki analizy RNA

biologia
biotechnologia

fakultatywne
nieobowiązkowe

Genetyka molekularna 1400-215GEBM
Genetyka z inżynierią genetyczną 1400-114GEN

Student powinien posiadać podstawową wiedzę z zakresu biologii molekularnej, co najmniej w zakresie realizowanym w ramach przedmiotu "Genetyka z inżynieria genetyczną" (kod przedmiotu 1400-114GEN; lub podobny). Dobrze, ale nie jest to warunek konieczny, gdy student wcześniej uczestniczył w fakultecie dotyczącym technik molekularnych, np. "Genetyka molekularna" (kod przedmiotu 1400-215GEBM; lub podobny).

Konieczne umiejętności praktyczne, które powinien posiadać student: podstawy pracy laboratoryjnej – praca sterylna z hodowlami mikrobiologicznymi, obsługa pipet automatycznych, elektroforeza w żelach agarozowych, przygotowywanie prostych reakcji enzymatycznych (PCR).

Mile widziana ciekawość "Świata RNA".

w sali

Przedmiot jest skierowany do studentów wszystkich kierunków Wydziału Biologii UW oraz MISMaP, zainteresowanych metabolizmem RNA oraz nowoczesnymi, molekularnymi technikami wykorzystywanymi w badaniu RNA.

Wykłady:

1. „Świat RNA” cz. 1.

Koncepcja „RNA world”. Nagrody Nobla w dziedzinie RNA. Katalityczne cząsteczki RNA – klasy, mechanizm, występowanie. SELEX. Pozostałości świata RNA - rybosom, splajsosom, wirusy RNA. Różnorodność klas RNA u Eukaryota i ich metabolizm. Podstawowe mechanizmy regulacji ekspresji genów od transkrypcji do translacji. Procesy alternatywne. Mechanizmy kontroli jakości RNA. Struktury rybonukleoproteinowe, kondensaty komórkowe.

2. „Świat RNA” cz. 2.

3. „Przegląd technik opartych o odwrotną transkrypcję. Techniki badania transkrypcji: TRO, ChIP, RIP i DIP. Analiza końców poliA RNA”.

Teoria odwrotnej transkrypcji (RT). Przegląd technik opartych o RT: RT-PCR w tym półilościowy, pulsacyjny RT-PCR, RACE, cRT-PCR, technika wydłużania startera ("primer extension"). Techniki badania nowopowstajacych transkryptów: jądrowy „Transcription Run-On“, immunoprecypitacja chromatyny (ChIP), immunoprecypitacja RNA (RiP). Do zilustrowania powyższych techniki posłużą badania terminacji transkrypcji Polimerazy I RNA. Specyficzność wiązania DNA przez czynniki transkrypcyjne: „ChIP on chip“, immunoprecypitacja DNA (DIP). Badanie końców poliA RNA (technika PASE, izolacja frakcji RNA poliA+).

4. „Niekodujące RNA”.

Niekodujące RNA (ang. non-coding RNA; ncRNA). Biogeneza i funkcje małych i długich niekodujących RNA. Mechanizmy wyciszania transkrypcji zależne od niekodujących RNA. Kompleksy RNP biorące udział w wyciszaniu transkrypcji. Rola chromatyny w regulacji ekspresji genów.

5. „Świat RNA” cz. 3.

6. „PCR w czasie rzeczywistym (ilościowy; qPCR)”.

Teoria qPCR: sposoby detekcji DNA, podstawy projektowania starterów, sondy hybrydyzacyjne, wprowadzenie do obliczeń. Zastosowania: określanie poziomu badanych transkryptów w komórce, wykrywanie kwasów nukleinowych patogenów, detekcja pojedynczych mutacji (SNP). Dobra praktyka laboratoryjna przy doświadczeniach qPCR i najczęstsze „pułapki czekające” na eksperymentatorów.

7. „RNA w neuronach“.

Transport mRNA do wypustek komórek nerwowych i lokalna translacja w odpowiedzi na pobudzenie synaptyczne. Metody wizualizacji mRNA z żywym neuronie w czasie rzeczywistym, hybrydyzacja in situ, metody biochemiczne pozwalające na bezpośrednią detekcję transkryptów ulegających lokalnej translacji w neuronach.

8. „Udział metabolizmu RNA w procesach fizjologicznych”.

Czynniki metabolizmu RNA i miRNA u roślin – rola w przekazywaniu sygnałów hormonalnych, rozwoju embrionalnym i generatywnym, zegarze dobowym, odporności na stres i patogeny.

9. „Badanie enzymów metabolizmu RNA na przykładzie egzosomu”.

Ścieżki rozkładu RNA w organizmach eukariotycznych. Egzo- i endo- nukleazy. Egzosom: wielofunkcyjny i wieloskładnikowy kompleks. Badania strukturalne i funkcjonalne egzosomu u drożdży i w komórkach ludzkich. Mechanizm działania, współpraca aktywności egzo- i endo-nukleolitycznej.

10. „Struktura RNA a funkcja. Mapowanie struktury RNA in vitro. Metody badania transkryptomów”.

Mapowanie struktury RNA in vitro: sondy molekularne trawiące specyficznie względem struktury i sekwencji RNA. Przełączniki RNA i aptamery – naturalne oraz wyselekcjonowane na potrzeby leków lub biosensorów. Wysokoprzepustowe metody badania transkryptomów oparte o techniki sekwencjonowania nowej generacji (RNA-seq, ChIP-seq).

11. „Metody badań strukturalnych RNA”.

Metody badania struktur kompleksów RNA-białko, metody krystalizacji kompleksów RNP (na przykładzie rybosomu, snRNP, RNazy H). Porównanie krystalografii i badań NMR dla RNA. Technika SAXS. Chemiczne (SHAPE) i bioinformatyczne przewidywanie struktur RNA. Technika mikroskopii elektronowej w niskich temperaturach (Cryo-EM).

12. „Globalne analizy kompleksów rybonukleoproteinowych“ cz. 1.

Metody biochemiczne czyszczenia kompleksów rybonukleoproteinowych (RNP). Chromatografia RNA i metody wysokoprzepustowe kompleksów RNP połączone z sekwencjonowaniem RNA NGS i spektrometrią mas. Analizy transkryptomu, translatomu i proteomu. Wysokoprzepustowe badania chromatyny, struktury RNA i oddziaływań RNA-RNA, RNA-DNA i RNA-białko. Metody wizualizacji pojedynczych cząsteczek RNA, transkrypcji i translacji w żywych komórkach. Analiza kompleksów RNP w komórkach metodami znakowania zbliżeniowego.

13. „Globalne analizy kompleksów rybonukleoproteinowych“ cz. 2.

Część wykładów będzie prowadzona przez zaproszonych gości.

Ćwiczenia:

1. Podstawy pracy z RNA. Izolacja RNA z drożdży i z roślin.

2. Ocena jakości RNA. Rozdział w żelach. Radioizotopowe i fluorescencyjne metody detekcji RNA. Detekcja miRNA u roślin - wprowadzenie. Detekcja miRNA u roślin, technika Northern-blot (1) z rozdziałem RNA w żelu poliakrylamidowym.

3. Technika Northern-blot (1): hybrydyzacja z sondą oligonukleotydową znakowaną biotyną. Płukania, skan i analiza wyników. Wykrywanie transkryptów CUT u drożdży: technika Northern-blot (2) z rozdziałem RNA w żelu agarozowym.

4. Detekcja CUT u drożdży: znakowanie sondy metodą "asymetryczny PCR" i hybrydyzacja. Analiza obrazu w nauce.

5. Detekcja CUT u drożdży: omówienie wyników hybrydyzacji Northern-blot (2). Analiza końców 3' małych jąderkowych RNA (snoRNA) przy pomocy cRT-PCR. Cięcie Rnazą H dupleksów RNA-oligonukleotyd i ligacja (cyrkularyzacja) RNA.

6. Analiza końców 3' snoRNA: RT + PCR.

7. cRT-PCR: rozdział produktów w żelu i omówienie ich sekwencjonowania. Wykrywanie mRNA metodą RT-qPCR. Projektowanie starterów do qPCR - teoria i praktyka. Konkurs na najwydajniejszą parę starterów, tzn. każdy student zaprojektuje przynajmniej 1 parę starterów, która zostanie zamówiona i przetestowana na następnych zajęciach.

8. Przeprowadzenie reakcji qPCR: testowanie zaprojektowanych starterów dla wybranych genów.

9. Analiza wyników reakcji qPCR. Eksploracyjna analiza danych transkryptomicznych - wprowadzenie.

10. Oznaczenia biochemiczne aktywności enzymów degradujących RNA. Analiza aktywności rybonukleolitycznych różnych wersji białka Dis3 - głównej podjednostki katalitycznej kompleksu egzosomu; badanie wrażliwości aktywności egzorybonukleolitycznej 5'-3' białka Xrn1 na status fosforylacji końca 5' substratu; reakcje degradacji syntetycznych oligonukleotydów RNA znakowanych fluorescencyjnie, rozdział produktów reakcji w denaturującym żelu poliakryloamidowym.

11. Eksploracyjna analiza danych transkryptomicznych i translatomicznych pochodzących z eksperymentów opartych na RNA-seq - ćwiczenia bioinformatyczne.

12. EMSA. Oddziaływania białka - kwasy nukleinowe. Wiązania drożdżowego białka Nsi1 z rDNA. Fluorescencyjny "gel-shift" (inkubacja prób, rozdział w natywnym żelu poliakrylamidowym, skan).

13. Prezentacje studentów na zaliczenie ćwiczeń.

Skrypt do zajęć oraz podręczniki „Genomy” T. Brown, „Genetyka molekularna” red. P. Węgleński, „Podstawy biologii molekularnej” L. A. Allison; literatura uzupełniająca: publikacje naukowe (doświadczalne i przeglądowe) wskazane w trakcie zajęć przez prowadzących; „Molecular Cloning: A Laboratory Manual” J. Sambrook i D. Russel 3-cia edycja lub 4-ta edycja M. R. Green and J. Sambrook.

Ma wiedzę na temat metabolizmu RNA u Eukariota.

Zna etapy ekspresji różnych klas RNA, ze szczególnym naciskiem na procesy współ- i po-transkrypcyjne, potrafi podać przykłady oddziaływań RNA - białko oraz zaangażowania cząsteczek RNA w procesy fizjologiczne.

Ma wiedzę dotyczącą enzymów modyfikujących RNA.

Posiada wiedzę teoretyczną i praktyczną pozwalającą na interpretowanie zjawisk i procesów związanych z metabolizmem RNA w oparciu o wyniki doświadczalne.

Samodzielnie planuje i przeprowadza podstawowe typy doświadczeń.

Zna słownictwo dot. metabolizmu RNA zarówno w jęz. polskim jak i angielskim, potrafi komunikować się i podejmować dyskusję na tematy związane z metabolizmem RNA.

Zna teoretyczne podstawy technik molekularnych wykorzystywanych do badania RNA, w stopniu pozwalającym na zrozumienie publikacji naukowych z tej dziedziny.

Potrafi krytycznie analizować otrzymane dane i je rzetelnie prezentować, co przyczynia się do podtrzymywania etosu zawodowego i rozwija zasady etyki zawodowej.

Językowe efekty uczenia się:

Wykorzystuje w sposób biegły naukowe i popularnonaukowe teksty biologiczne w języku ojczystym i angielskim oraz komunikuje się w języku angielskim na poziomie B2+ (K_U03 Bi2).

Posiada umiejętność przygotowania i wygłoszenia wystąpień ustnych w języku polskim i angielskim, zgodnie z wymaganiami określonymi dla poziomu B2+ (K_U11 Bi2).

Wykazuje umiejętność posługiwania się językiem nowożytnym (angielskim) w stopniu umożliwiającym korzystanie z literatury naukowej i komunikację z cudzoziemcami (K_U02 Bt2).

Warunki zaliczenia ćwiczeń:

- zajęcia zaliczone mogą być jedynie, jeśli student uczestniczył w nie mniej jak 85% zajęć,

- ćwiczenia zaliczane są na ocenę, na którą składają się punkty uzyskane za prezentacje przedstawiane przez studentów, dotyczące publikacji naukowych, w których stosowano techniki badania RNA (waga w końcowej ocenie - 2/3) oraz punkty uzyskane z prac domowych (waga w końcowej ocenie - 1/3),

- temat końcowej prezentacji student wybiera spośród propozycji prowadzących, ewentualnie student sam może zaproponować publikację ale wybór zawsze musi być zatwierdzony przez koordynatora,

- prezentacje w stylu otwartym, tzn. dopuszczamy pytania w trakcie prezentacji ze strony prowadzących jak i pozostałych uczestników kursu.

Warunki egzaminu końcowego z całego przedmiotu:

- przedmiot zaliczany jest na ocenę,

- do egzaminu może przystąpić jedynie student, który zaliczył ćwiczenia,

- egzamin testowy: test jednokrotnego wyboru (4 warianty odpowiedzi na każde pytanie),

- aby zaliczyć egzamin student musi uzyskać nie mniej niż 50% punktów.

Nie są wymagane.